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探针法荧光定量PCR试剂盒制备工艺流程

更新时间：2024-09-06　点击量：77

　　探针法荧光定量PCR试剂盒制备工艺流程主要包括核酸提取、反转录、探针设计合成、反应体系配制以及荧光定量PCR检测等步骤。具体流程如下：

　　1.核酸提取

　　样本准备：采集目标样本，如组织、血液或细胞。

　　RNA 提取：使用QIAGEN RNeasy Mini Kit或其他类似试剂盒，按照说明书进行RNA提取，确保RNA的纯度和完整性。

　　DNA 提取：若需从样本中提取DNA，采用相应的基因组DNA纯化试剂盒进行操作。

　　2.反转录

　　cDNA 合成：将提取的RNA反转录成cDNA，通常使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser，此试剂盒包含去除基因组DNA的gDNA Eraser和反转录酶。

　　DNase I处理：在反转录前对Total RNA样品进行DNase I处理，以除去残存的基因组DNA，避免对后续实验造成干扰。

　　3.探针设计合成

　　探针设计：根据目标基因序列设计特异性探针，一般选择与目标序列匹配的寡核苷酸探针，并在5’端标记荧光报告基团，3’端标记淬灭基团。

　　探针合成：利用自动化核酸合成仪器进行探针的化学合成，并纯化得到的探针以确保其质量。

　　混合试剂：将PCR酶、dNTPs、缓冲液、Mg??、引物、探针和模板cDNA按比例混合，形成完整的PCR反应体系。

　　分装反应液：将混合好的反应液分装到PCR管或多孔板中，每个反应单元体积一致，确保实验结果的准确性和重复性。

　　5.荧光定量PCR检测

　　PCR 扩增：在实时荧光定量PCR仪器中进行扩增，通过设定特定的循环参数（变性、退火、延伸）来控制PCR过程。

　　荧光数据采集：仪器在每个循环后自动采集荧光数据，实时监测荧光信号的变化，并根据Ct值计算初始模板量。

　　数据分析输出：软件自动生成扩增曲线和熔解曲线，并进行数据分析，输出检测结果。