探针法荧光定量PCR试剂盒存放与使用注意

　　探针法荧光定量PCR试剂盒的存放与使用需特别注意温度控制、避免污染和正确操作等。该试剂盒主要用于病毒检测和研究实验中对特定基因表达量的精确测定。由于其灵敏度高，任何小的操作失误都可能影响实验结果的准确性。

　　首先，在使用前要确保总RNA的完整性和纯度。RNA的质量直接影响到cDNA合成的效率和后续PCR的结果。通过使用NanoDrop 2000或Agilent 2100 Bioanalyzer系统可以检测RNA质量，而甲醛胶电泳则是一种更为传统但同样有效的方法。这些步骤需要在无核酸酶的环境中进行，以防止RNA降解。

　　其次，是优化cDNA的合成。实验室通常采用不同的反转录方法来获取cDNA，但其浓度往往需要通过预实验确定最佳稀释倍数。这可以通过使用管家基因进行常规RT-PCR来实现，以确保cDNA的量适合荧光定量PCR的要求。

　　在使用探针法荧光定量PCR试剂盒时，应严格遵循制造商提供的说明书，并注意以下几点：

　　1.温度控制：

　　试剂盒应在-20℃下保存，使用前解冻并立即放回冷冻保存。

　　所有反应体系配制应在冰上进行，以保持酶和其他试剂的活性。

　　2.避免污染：

　　所有操作都应在超净工作台内进行，工作台需紫外照射至少15分钟以消毒。

　　实验过程中必须佩戴无菌手套和口罩，尽量避免交谈，以防模板污染。

　　3.正确操作：

　　在加样过程中，建议先加入模板和其他反应组分，最后加入Taq聚合酶，以减少酶在室温下的暴露时间。

　　使用专用的qPCR光学管，以避免使用普通PCR管可能带来的荧光信号干扰。

　　完成加样后，建议通过瞬离将反应液离至管底，并消除溶液中的气泡，因为气泡会干扰荧光检测且降低酶活性，从而降低扩增效率。